​

¹Fethiye ÇÖVEN, ²Ruth MANVELL, ³Gülşen ORHAN, ⁴Ayşegül GENÇ,

¹Nejdet ÇÖVEN

ÖZET: Bu çalışmada 1993 - 1995 yılları arasında Manisa, İzmir, Bursa, Ankara, Konya illeri ve çevresindeki 15 mihrakta, Newcastle Hastalığı (NDV) salgınlarının yaşandığı dönemlerde, hastalık şüphesi bulunan sürülerden sorumlu etkenin  izolasyonu ve  identifikasyonu yapılmıştır.

APMV' ların  izolasyonu için ölen hayvanlardan alınan beyin, trachea, akciğer, bağırsak ve dalak örnekleri kullanılmıştır.

İzolasyon çalışmalarında şüpheli materyallerin,  embryolu SPF yumurtada çoğalarak embryolarda yaygın hemorajiler ile karakterize lezyonlar oluşturduğu ve embryo ölümlerine sebep olduğu dikkati çekmiştir. CEF hücre kültüründeki pasajlarda ise bir izolat hariç diğerlerinin CPE'ler oluşturarak çoğaldıkları tespit edilmiştir.

İzolatların karakterizasyon çalışmalarında hemaglutinasyon (HA), hemaglutinasyon-inhibisyon testi (HI), monoklonal antikor tiplendirmesi, elüsyon zamanının tespiti ve kloroforma duyarlılık testi kullanılmıştır.

Yapılan HA testlerinde, ETY ve hücre kültüründe ürediği saptanan tüm izolatların HA aktivitesine sahip viruslar oldukları ve hemaglutinasyonun NDV La Sota suşuna karşı hazırlanmış antiserum ile inhibe olduğu saptanmıştır. Tüm izolatların kloroforma duyarlı oldukları ve tavuk eritrositlerinden elüsyon zamanının 3 izolatta hızlı, diğerlerinde yavaş olduğu ortaya konulmuştur.

APMV-1 olarak identifiye edilen izolatlar arasından seçilen 3 örneğin Weybridge Merkez Veteriner laboratuvarında monoklonal antikorlar kullanılarak ileri identifikasyon çalışmaları yapılmış ve 1 izolatın "güvercin" tipi PMV-1 (PPMV-1) diğer 2 izolatın ise velojenik karakterde PMV-1 olduğu saptanmıştır.

Patojenite testlerinde ise, embryo MDT ve ICPI testleri kullanılmıştır. Bu testler sonucu bir izolatın lentojenik, bir izolatın mezojenik diğerlerinin ise velojenik karakterde  suşlar oldukları  ortaya konulmuştur.

Anahtar Kelimeler: NDV, virus izolasyonu, identifikasyonu

¹Dr Uzm.Vet.Hek Tavuk Hastalıkları Araştırma ve Aşı Üretim Enstitüsü,  MANİSA

² Dr Viroloji Departmanı CVL, Weybridge, İNGİLTERE

³ Dr Uzm. Vet. Hek. Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü, KONYA

⁴Dr Vet. Hek. Tellioğlu Yem – Gıda Sanayi AŞ, BALIKESİR

¹Dr Vet. Hek  Tavuk Hastalıkları Araştırma ve Aşı Üretim Enstitüsü  MANİSA

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF AVIAN PARAMYXOVİRUSES  FROM NEWCASTLE DISEASES SUSPECTED BROILER AND LAYER FLOCKS

ABSTRACT : This study was conducted on, between 1993-1995, in 15 Newcastle Diseases suspected flocks in Manisa, İzmir, Bursa, Ankara, Konya districts.

For virus isolation; brain, trachea, lung, intestine and spleen samples were used. In isolation studies suspected materials induced severe gross  hemorragic lesions in the embryos and caused  embryo deaths. Except one sample all materials caused CPE in CEF cultures.

For characterization studies of isolates, HA, HI test, Monoclonal antibody binding pattern, chloroform resistance test and the rate of elustion  were used.

In HA tests all the isolates which grown in embryoneted eggs and CEF culture, gave HA activity and all isolates were inhibited ND virus positive sera which raised against to La Sota strain in HI test.

 All isolates were resistant to chloroform and the elution rate was rapid in three isolate and slow in the rest.

For further characterisation studies, Monoclonal antibody typing (mAb) for the 3 isolates was carried out in CVL. Out of three, one isolate was placed in Pigeon Paramyxovirus-1 group and, two viruses were identified as Avian Paramyxovirus Serotype-1 virus, in velogenic group.

In pathogenicity tests, MDT and ICPI tests were used. As a results of those tests one isolate  was lentogenic, one was mesogenic and the rest of them were  found as velogenic strains.

Key Words: NDV, virus isolation, identification

GİRİŞ

Newcastle hastalığı hem evcil hemde yabani kanatlılarda görülen bir virus infeksiyonu olup, kanatlı hayvan yetiştiriciliği yapılan bütün ülkelerde büyük problemler yaratan en tehlikeli hastalıklardan birisini oluşturmaktadır. Newcastle hastalığı virusu Paramyxoviridae familyasından Avian Paramyxovirus-1  (APMV-1) serogurubundan bir virustur.

NDV’nin kanatlıları infekte eden tek PMV olarak bilinmesine rağmen bugün PMV-1'den PMV-9'a kadar sıralanan avian PMV'lar bu gurup içerisinde yer almaktadır (6). NDV PMV-1 ile eş anlamlı olarak bilinmektedir.

Yapılan yoğun araştırmalar sonucunda Avrupa'da 1980'li yıllarda Panzooti yaratan virusun PMV-1 gurubu içerisinde olduğu fakat antijenik olarak aralarında farklılıkların bulunduğu saptanmış, bu salgınlardan izole edilen suş PMV-1 gurubu içerisinde bir varyant suş olarak kabul edilmiş ve "güvercin" suşu (Pigeon Paramyxovirus-1, PPMV-1) olarak adlandırılmıştır (1).

Virus karakteristik olarak helikal yapıda olup, 100-500 nm çapındadır. Virus partikülleri lipid içeren bir zarfla çevrilmiş ve nükleik asidi RNA yapısındadır.

İnfeksiyon kanatlılarda hafif seyreden formlardan çok şiddetliye varan değişik formlarda görülür. Hastalık olgularında klinik bulgular genellikle başta tremor, kanat ve bacaklarda felç, ataksi, tortikollis, hareketlerde yavaşlama, durgunluk, tüy kalitesinde bozuklukların oluşması, yeşilimsi sulu ishal ve neticede ölüm ile karakterizedir (11,22,24).

MATERYAL VE METOD

Materyal

Şüpheli Materyaller: Bu çalışma Manisa ve İzmir, Bursa, Ankara, Konya illeri ve çevresinde, hastalık şikayetlerinin olduğu toplam 15 mihrakta yürütülmüştür. Tavuk sürülerinin bir kısmında hastalığın çok ağır seyrettiği ve mortalite oranının oldukça yüksek olduğu dikkati çekmiştir. Bunun yanı sıra bazı sürülerde ise sadece yumurtanın pike çıktığı dönemde, kısa süreli olarak  % 10-15 oranında bir  verim düşüklüğü ve kalitede bozukluğun olduğu bildirilmiştir.

Virus izolasyonu için, hasta ve ölü hayvanlardan alınan beyin, trachea, akciğer, bağırsak ve dalak örnekleri kullanılmıştır.

Standart Virus Suşları: HI testinde kullanılacak olan antijen ve antiserumların hazırlanması için gerekli olan NDV La Sota suşu ve APMV 2,3,4,6,7,8,9 suşları Manisa Tavuk Hastalıkları Araştırma ve Aşı Üretim Enstitüsü Antijen ve Antiserum Üretim Laboratuvarından sağlandı.

Embriyolu Yumurta ve Civcivler: Embriyo inokulasyonları, antijen üretimi ve civciv embriyo fibroblast (CEF)  hücre kültürü hazırlanması için gerekli olan embriyolu yumurta, antiserum hazırlanması ve patojenite testlerinde kullanılan civcivler Manisa Tavuk hastalıları Araştırma ve Aşı Üretim Enstitüsünde yetiştirilen specific pathogen free (SPF) sürülerden sağlandı.

Metod

Avian Paramyxovirus Suşlarına  Karşı Antijen Hazırlanması: HI testinde kullanılan APMV- 1,2,3,4,6,7,8 ve 9 suşlarına karşı antijenler Allan ve ark. tarafından bildirilen metoda göre hazırlandı (5).

Avian Paramyxovirus Suşlarına  Karşı Antiserum Hazırlanması: HI testinde kullanılan APMV- 1,2,3,4,6,7,8 ve 9 suşlarına karşı antiserumlar Allan ve ark. tarafından bildirilen metoda göre hazırlandı (5).

Şüpheli Materyallerden İnokulum Hazırlanması: İzolasyon çalışmalarında kullanılan  organ numuneleri OIE tarafından bildirilen metoda göre hazırlandı ( ).

Materyallerin Embriyolu Tavuk Yumurtasına İnokulasyonu: Embryolu yumurtaya inokulasyon işlemi OIE tarafından bildirilen metoda göre yapıldı ( ).

Civciv Embriyo Fibroblast (CEF) Hücre Kültürü Hazırlama ve İnokulasyon: Hücre kültürüne inokulasyon işlemi Alexander ve ark. tarafından bildirilen metoda göre yapıldı (9).

İzolatların karakterizasyon çalışmaları

Hemaglutinasyon Testi (HA) :  Embriyolu yumurtalardan elde edilen infektif amnioallantoik sıvılarda NDV'nun varlığını ortaya koymak amacıyla uygulanan HA testi Allan ve ark. tarafından bildirilen yöntem ile yapıldı (8).

Hemaglutinasyon-Inhibisyon Testi (HI) :  Hemaglutinasyon aktivitesi olduğu saptanan infektif amnio-allantoik sıvılarda NDV’nin varlığını ortaya koymak amacı ile uygulanan HI testi Allan ve ark. tarafından bildirilen yöntem ile çalışıldı (8). İncelenen infektif amnio-allantoik sıvılar, NDV'na karşı hazırlanmış olan antiserumlar ile identifiye edildi.

Monoklonal Antikor (mAb)  Tiplendirmesi:  İzole edilen viruslar arasından seçilen 3 izolat Weybridge Merkez Araştırma Laboratuvarında mAb'lar kullanılarak tiplendirildi. İlk olarak virusların hızlı karakterizasyonu amacıyla HI özelliği gösteren üç monoklonal antikor kullanılarak HI testi uygulandı. Tüm klasik NDV suşları için spesifik olan U85, güvercin variant virusları için spesifik olan 617/161, LaSota ve F suşu için spesifik olan 7D4 mAb'ları kullanıldı..

İkinci olarak ise izolatların mAb bağlanma yapıları aşağıdaki mAb'lar kullanılarak Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) hücre kültürlerinde indirekt immunoperoxidase (IIP) ile saptandı. Testte kullanılan mAb'lar, A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,N,O,P,Q,R,S,T,U ve V Ulster 2C suşuna spesifiktirler ( ). W,X,Y,Z,161/617 ve 165/617 ise  güvercin variant ND virusları için spesifiktirler (5,23).

 Kloroforma Duyarlılık Testi: Test Feldman ve ark. tarafından bildirilen metoda göre yapıldı. (15).

Elüsyon Zamanın Tesbiti : Test Hanson tarafından bildirilen metoda göre yapıldı (16).

Patojenite Testleri        

Embriyo Ortalama Ölüm Zamanı Tespiti (MDT) : Test Alexander  tarafından bildirilen metoda göre yapıldı (7).

Intracerebral Patojenite Indexi (ICPI) : Test Alexander tarafından bildirilen metoda göre yapıldı (7).

BULGULAR

Çalışma, Newcastle hastalığı şüphesinin olduğu  Manisa, İzmir, Bursa, Ankara, Konya  illeri ve çevresinde toplam 15 mihrakta yürütülmüştür. Tavuk sürülerinin bir kısmında hastalığın çok ağır seyrettiği ve mortalite oranının oldukça yüksek olduğu dikkati çekmiştir. Bunun yanı sıra bazı sürülerde ise sadece yumurtanın pike çıktığı dönemde, kısa süreli olarak verimde % 15-20 oranında bir düşme ve kalitede bozukluğun olduğu bildirilmiştir.

APMV’ların izolasyonu için, ölen hayvanlardan alınan beyin,  trachea, akciğer, bağırsak ve dalak örnekleri kullanılmıştır.

NDV suşları embriyolu tavuk yumurtasında embriyopati'ler oluşturarak hızla çoğalırlar. Bu araştırmada yapılan izolasyon çalışmalarında embriyolu SPF yumurta kullanılmıştır. Şüpheli materyallerin 9-10 günlük SPF embriyolu yumurtada yapılan pasajlarında, inokulasyonlardan sonra izolatların çoğalarak embriyolarda yaygın hemorajiler ile karakterize lezyonlar oluşturduğu ve embriyo ölümlerine sebep olduğu dikkati çekmiştir. Newcastle hastalığının birçok suşu, doku kültürü sistemlerinde değişik hücre tiplerini infekte eder ve hücrelerde değişik derecelerde bozukluklar oluştururlar.  Virulent virus suşları genellikle infeksiyondan 4 saat sonra hücre füzyonu ve dökülmeleri oluşturarak çoğalır. Bu çalışmadaki tüm şüpheli materyallerin civciv embriyo fibroblast (CEF) hücre kültüründe pasajları yapılmıştır. İzmir yöresine ait bir izolat CEF hücre  kültüründe 4 kez pasaj edilmesine rağmen hücrelerde hiçbir değişiklik yapmamıştır. Diğer izolatların ise hücrelerde 6-72 saat içerisinde yaygın sinsitia  ve hücre dökülmeleri ile karakterize CPE'ler oluşturarak çoğaldıkları tespit edilmiştir.

İzolatların karakterizasyon çalışmalarında HA testi, HI testi, monoklonal antikor tiplendirmesi, kloroforma duyarlılık testi ve elusyon zamanının tespiti kullanılmıştır.

Yapılan HA testlerinde embriyolu tavuk yumurtası ve hücre kültürlerinde üreme özelliğine sahip olduğu saptanan tüm izolatların HA olan viruslar oldukları ortaya konmuştur.

Ayrıca hemaglutinasyonun, NDV’nin La Sota suşuna karşı tavuklarda hazırlanan antiserum ile inhibe olduğu tespit edilmiştir.

Tavuk eritrositlerinden elüsyon zamanının 3 izolatta hızlı, diğerlerinde yavaş olduğu tespit edilmiştir.  İzolatların hepsinin kloroforma duyarlı oldukları bulunmuştur. 

 Avian Paramyxovirus-1 olarak identifiye edilen  bu izolatlar arasından seçilen 3 örnek  İngiltere Weybridge Merkez Veteriner Laboratuvarına gönderilmiş ve monoklonal antikorlar kullanılarak yapılan ileri identifikasyon çalışmalarında 1 izolatın "güvercin" tipi PMV-1 (PPMV-1), diğer iki izolatın ise velojenik karakterde PMV-1 olduğu tespit edilmiştir.

Patojenite testlerinde ise, embriyo ortalama ölüm zamanının tespiti (MDT) ve intracerebral patojenite indexi (ICPI) kullanılmıştır.

Yapılan patojenite testlerinde izolatların lentojenik, mezojenik ve velojenik karakterde suşlar olduğu ortaya konulmuştur.

Tablo 1:  İzolatların kloroforma duyarlılık, HA, HI, Elüsyon zamanı,  ETY ve doku     kültüründe etki özellikleri

HA    : Hemaglutinasyon

HI     : Hemaglutinasyon-Inhibisyon

ETY : Embriyolu Tavuk Yumurtası

CEF  : Civciv Embriyo Fibroblast

Tablo 2 :  NDV İzolatlarının patojenite  test sonuçları

EID: Embryo infektif doz

MLD: Minimum lethal doz

MDT: Ortalama ölüm zamanı

ICPI: Intraserebral patojenite indeksi

TARTIŞMA VE SONUÇ

İlk defa 1926 yılında Uzakdoğu'da Java Adalarında görülen ve esas tanınması İngiltere'nin Newcastle- kasabası yakınlarında ortaya çıkan Newcastle hastalığı Türkiye'de ilk defa 1946 yılında görülmüş ve geniş bulaşmalara yol açmıştır. Hijyenik tedbirler ve sistematik aşılama programlarına rağmen zaman zaman epidemik karakterde hastalık çıkışı olmakta ve halen kanatlıların önemli hastalıkları arasındaki yerini korumaktadır.

Ülkemizde  Newcastle hastalığı konusunda çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Bu konuda 1988-1991 yılları arasında yapılan bir çalışmada Ege Bölgesinde çeşitli tavuk çiftliklerinde görülen Newcastle hastalık salgınlarından 7, hindiden 1, güvercinden 1 adet olmak üzere toplam 9  vakadan virus izolasyonu yapılmış ve izole edilen viruslar viscerotropik velojenik Newcastle hastalığı virusları olarak gruplandırılmışlardır.  

 Güney Marmara bölgesinde 1991- 1993 yılları arasında yapılan bir çalışmada Newcastle hastalığının problem olduğu işletmelerde, köy tavukları ve güvercinlerden NDV izole edilmiş ve tüm izolatların velojenik viruslar olduğu yapılan patojenite testleri ile ortaya konulmuştur. Yapılan ileri karakterizasyon testlerinde bu izolatların 1991-1995 yılları  arasında Portekiz'de ortaya çıkan salgınlardan izole edilen viruslarla çok benzer olduğu tespit edilmiştir.  İki ülke arasındaki epidemiyolojik bağıntı olmamasına rağmen aynı antijenik karakterde olan bu virusun Türkiye'ye nasıl geldiği bilinmemektedir.

Türkiye'de yaşanan yoğun infeksiyöz bursal  hastalığı salgınları sırasında, 1990-1995 yılları arasında bu hastalık ile ilgili yapılan çalışmalarda, hastalığın görüldüğü sürülerin bir kısmında  bacaklarda felç ile karakterize sinirsel semptomların varlığı da dikkati çekmiş ve  bu sürülerin % 49.4'ünde IBDV’nin yanı sıra HA aktivitesi olan virusların varlığı tespit edilmiş ve yapılan identifikasyon çalışmalarında bu virusların NDV olduğu ortaya konmuştur.

 İzmir yöresinde 1997 yılında yapılan bir çalışmada evcil güvercinlerde PMV-1 enfeksiyonu seroepidemiyolojik olarak çalışılmış, alınan kan serumlarının % 80.3' ünde PMV-1'e ait antikor titresi saptanmıştır. Aynı zamanda bu güvercin sürülerinde klinik olarak da  Newcastle hastalığına özgü tipik semptomların bulunduğu bildirilmiştir.  

İzmir ve Manisa yöresinde  1993-1996 yılları arasında evcil ve yabani güvercinlerde çok sık görülen ve Newcastle hastalığının sinirsel formuna benzeyen hastalık olgularında, sorumlu ajanın izolasyonu ve karakterizasyonu yapılmıştır. Bu çalışmada İzmir ve Manisa illeri ve çevresinde bulunan, hastalık semptomu gösteren 8, sağlıklı görünümde olan 1 evcil güvercin sürüsünden ve ölü olarak bulunan 3 kumrudan alınan organ materyallerinden virus izolasyonu yapılmış ve HA aktivitesi olduğu saptanan izolatların PMV-1'e karşı hazırlanan antiserumlar kullanılarak yapılan HI testlerinde inhibe oldukları saptanmıştır. Weybridge Merkez Araştırma Laboratuvarında monoklonal antikorlar kullanılarak yapılan ileri karakterizasyon testlerinde 5 güvercin ve  2 kumru izolatının PMV-1'in bir varyantı olan ve "güvercin suşu olarak adlandırılan PPMV-1 (PPMV-1) olduğu ortaya konmuştur.

Yumurtacı ve broyler sürülerde görülen Newcastle hastalığı salgınlarından avian Paramyxovirusların  izolasyonu ve identifikasyonu  konulu bu çalışmada, yoğun Newcastle hastalığı salgınlarının yaşandığı dönemlerde hastalık şüphesi bulunan sürülerde sorumlu etkenin izolasyonu ve identifikasyonu yapılmıştır.

Sonuç olarak, Newcastle hastalığı tavuklarda yapılan sistematik aşılama programlarına rağmen zaman zaman salgınlar halinde ortaya çıkmakta ve önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır.

Newcastle hastalığı Türkiye’de de tavukların yanı sıra güvercinlerde de ciddi salgınlara sebep olmaktadır. Güvercin yetiştiriciliği genellikle hobi tarzında olduğundan bunlarda şekillenen hastalık olguları üzerinde pek durulmamakta ve dolayısıyla da hastalık sebebi tam olarak araştırılmamaktadır. Yine güvercinler için zorlayıcı bir aşı programı olmadığından aşı uygulamaları yapılmamaktadır.  Newcastle hastalığının güvercinlerde görülmesi, hastalığın epidemiyolojisi açısından büyük önem taşımaktadır. Özellikle sağlıklı görünümde olan güvercinlerden NDV izole edilmesi, bu kuşların yoğun olarak kanatlı yetiştiriciliği yapılan bölgelerde infeksiyonun rezervuarı olarak görev yapabilecekleri için  hastalığın yayılışında önem taşımaktadır. Aşılama ile büyük ölçüde kontrol altında tutulan Newcastle hastalığının yabani kanatlılarda bulunması hastalık riskinin tavukçuluk endüstrisinde her an var olduğunu göstermektedir.

KAYNAKLAR

1-     Alexander,D.J. (1980): Avian Paramyxoviruses. Veterinary Bulletin. 50,  737-752.

2-     Alexander,D.J., Collins,M.S. (1981): The Structural Polypeptides of Avian Paramyxoviruses. Archives of Virology. 67,  309-323.

3-     Alexander,D.J., Parsons,C. (1984): Avian paramyxovirus Type-1 Infection of Racing Pigeons: 2 Pathogenicity Experiments in Pigeons and Chickens Veterinary Record, 114,  466-469.

4-     Alexander,D.J. (1986): The Classification, Host Range and Distribution of Avian Paramyxoviruses. Acute Virus Infections of Poultry. Dordrecht, Martinus Nijhoff Publishers.  52-66.

5-     Allan, W.H., Lancaster,T.E., Toth,B. (1978): Newcastle Disease Vaccines, Food and Agriculture Organization of the United Nations Rome.

6-     Çöven, F., Çarlı, T. (1997) : Gumboro Salgınlarında Reovirus, Adenovirus ve Newcastle Hastalığı Virus İzolasyonu. Pendik Vet. Kont. Araşt. Enst. Yayını No 2, 153-161.

7-     Çöven,F., Alexander, D.J., Özdemir,İ., Mısırlıoğlu, Ö.Z. (1999), Güvercinlerde Paramyxovirus-1 İnfeksiyonunun Araştırılması. Bornova Vet.Kont.Arşt.Enst.Yayını 24 (38)1-10.

8-     Feldman,H.A., Wong,S.S. (1961) sensitivity of various viruses to chloroform. Proc.soc.Exp.Biol..Med., 106:736-740.

9-     Hanson,R.P. (1972): World Wide Spread of Viscerotropic Newcastle Diseases. Proc. 76^th Ann.Meet.U.S. Anem.Health. Assoc. Miami Iseach, Florida. Nov.5-10.

10- Hanson,R.P. (1972): Newcastle Disease, In Diseases of Poultry. 6 ^th Ed. By M.S. Hofstad, Iowa State University Press. Ames, Iowa.

11- Hitchner,S.B., Damermuth,C.N., Purchase,H.G., Williams,J.E. (1980): Isolation and Identification of Avian Pathogens, Published By “The American Association of Avian Pathologists”. Creative Printing Company, Inc. New York.

12- Mutlu,Ö.F. (1997): Evcil Güvercinlerde (Columba Livia Gmel.1789 var.Domestica) Paramyxovirus -1 Enfeksiyonları Üzerine Seroepidemiyolojik Çalışmalar. Bornova Vet.Kontr. ve Araşt. Enst. Md.Derg., 22(36), 73-84.

13- Office International Des Epizooties (1992). Manual of Standarts for Diagnostic Tests and Vaccines. Second Edition, 221-232.

14- Öncel,T., Alexander,D.J., Manvell ,R.J, and.Türe, O. (1997):  Characterization of Newcastle Diseases Viruses Isolated from Chickens and Pigeons in the South Marmara Region of Turkey. Avian Path.,26, 129-137.

15- Kaleta,E.F., Alexander,D.J., Russel,P.M. (1985): The First Isolation of the Avian PMV-1 Virus Responsible For the Current Panzootic in Pigeons. Avian Pathology.  553-557.

16- Lancaster,J.E., Alexander,D.J. (1975): Newcastle Disease Virus and Spread. A Review of Some of the Literature Monograph No.11. Canadian Deparment of       Agriculture, Ottowa.

17- Lipkind,M., Shihmanter,E. (1986): Antigenic Relationships Between Avian Paramyxoviruses, 1: Quantitative Characteristics Based on Hemagglutination and Neuraminidase Inhibition Tests. Archives of Virology. 89, 89-111.

18- Russell,P.H., Alexander,D.J. (1983): Antigenic Variation of Newcastle Disease Virus Strains Detacted By Monoclonal Antibodies. Archives of Virology 75,  243-253.