​

DIVA YAKLAŞIMINA YÖNELİK OLARAK,

SIĞIR BRUSELLOZİSİNİN TANISI İÇİN PROTEİN ELDESİ VE HIZLI TANI KİTİ GELİŞTİRİLMESİ

PROJE LİDERİ

Dr. Yasin GÜLCÜ

ARAŞTIRMACILAR

        Dr. Aslı SAKMANOĞLU

        Prof. Dr. Uçkun Sait UÇAN

     Doç.Dr. Zafer SAYIN

Öğr. Gör. Dr. Yasemin PINARKARA

Arş. Gör. Ali USLU

Dr. Eray ATIL

Prof. Dr. Osman ERGANİŞ

ÖZET:

     Brusellozis, insan ve hayvanlarda Brucella ssp. tarafından oluşturulan bulaşıcı ve genellikle, subakut ve kronik seyirli zoonoz bir enfeksiyondur. Bu enfeksiyona Akdeniz ülkelerinde, Asya kıtasının batısında, Afrika kıtasının bir kısmında, Latin Amerika'da daha sık rastlanılmaktadır. Ülkemizde de enfeksiyon yaygın olarak görülmektedir ve korunmada aşı kullanılmaktadır. Her ne kadar kompetetif ELISA kiti bulunmakta ise de, aşılı ve enfekte hayvan ayrımındaki güçlükler nedeniyle serolojik teşhiste zorluklarla karşılaşılmaktadır. Ayrımın yapılabilmesi için aşı antijeni, test antijeni ve saha suşları arasındaki antijenik benzerliklerinin yada farklılıklarının, DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) yaklaşımı/stratejisine (aşılı-doğal enfekte ayırımı) uygun olarak araştırılması gerekmektedir.

     Bu çalışmada enfekte ve aşılı hayvanların ayrımında DIVA yaklaşımına uygun olarak kullanılabilecek bir bölgenin belirlenmesi ve sahada uygulanabilir seroloji temelli hızlı teşhis kitinin geliştirilmesi amaçlandı. Çalışmada kullanılan toplamda 122 adet Brucella abortus suşu PZR SET1 ile teyit edildi. PZR SET 2 ile delesyon olmayan 40 adet suş olduğu belirlendi. B. abortus S19 (S19), B. abortus S99 suşları ve B. abortus saha izolatlarında, farklı DNA bölgelerinin belirlenmesine yönelik olarak oligonükleotid primerler dizayn edildi ve bu primerler kullanılarak Random Amplified Polimorfik DNA (RAPD) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) analizi gerçekleştirildi. RAPD-PZR sonuçlarına göre; B. abortus S99, B. abortus saha suşlarında 4 adet DNA bandı (850 bp, 550 bp, 400 bp ve 200 bp), B. abortus S19 suşunda 3 DNA bandı (550 bp, 400 bp ve 200 bp) ve B. melitensis izolatında 1 adet DNA bandı (200 bp) tespit edildi. RAPD-SCAR metodu ile 850 bp büyüklüğündeki bant saf olarak elde edildikten sonra dizi analizi yapıldı. BLAST analizi sonrasında hedef DNA diziliminin B. abortus ve B. melitensis saha suşlarında var iken B. abortus S19'da bulunmadığı belirlendi. Hedef bölgenin tanımlı dizilimler ile benzerliğinin yaklaşık %64 oranında olduğu tespit edildi. Uniprot analizi ile proteinin kromozom I'de yer alan glutathione transferase ailesi içerisinde yer aldığı ve moleküler ağırlığının yaklaşık 30 kDA olduğu belirlendi. DIVA'ya yönelik olarak yapılan çalışma sonuçları ile karşılaştırıldığında şimdiye kadar bildirilen bölgelerden farklı bir bölge olduğu belirlendi. Dizilimi ortak olan hedef DNA rekombinant protein üretimi basamaklarında kullanıldı. SDS-PAGE ve Western blot işlemleri ile rekombinant proteinin çözünür olduğu ve antijenik yapısının doğal antijen ile benzer olabileceği tespit edildi. Dot blot analiz sonuçlarına göre, standardizasyon işlemi ile 100 µg/ml rekombinant antijen ile 1/80 ve üzeri titreye sahip serumlar rekombinant antijenin aşılı hayvan serumları ile negatif sonuç vermesine karşın enfekte hayvan serumları ile pozitif sonuç verdiği belirlendi. ELISA sonuçlarına göre, hedef antijenin humoral immuniteyi uyarım gücünün düşük olmasına bağlı olarak antikor miktarının test edilebilecek güvenilir düzeye ulaşamamasından dolayı aşılı hayvan serumlarından alınabilecek sonuçları olumsuz yönde etkileyebileceği kanaatine varıldı.

Anahtar kelimeler: Brucella abortus, DIVA, rekombinant protein, seroloji

KONYA YÖRESİ BROYLER KÜMESLERİNDEN ALINAN KLOAKAL SVAP ÖRNEKLERİNDEN CAMPYLOBACTER JEJUNİ VE CAMPYLOBACTER COLİ TÜRLERİNİN İZOLASYONU VE İDENTİFİKASYONU

M. Levent KAYNAR, Dr. Kadri GÜNDÜZ, Uzm. Kamile KESLER,

Ali GÖK, Dr. Murat ŞEVİK, Yrd. Doç. Dr. Zafer SAYIN,

Arş. Gör. Dr. Aslı SAKMANOĞLU, Mustafa Emin ÖZ

Konya Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü

ÖZET:

     Bu proje ile Konya Yöresi Broyler Kümeslerinden alınan klokal svap örneklerinden Campylobacter jejuni (C. jejuni) ve Campylobacter coli (C. coli)'nin izolasyonu ve identifikasyonu amaçlanmıştır. 2014-2016 yılları arasında her kümesten 10 adet olmak üzere 50 farklı broyler kümesinden 500 kloakal svap örneği alınarak kültüre edildi. Elde edilen izolatların identifikasyonları konvansiyonel metot (sodium hippurate hydrolysis), ticari test kiti (ApiCAMPY system, bioMerieux, France) ve iki farklı multipleks PZR (Polimeraz zincir reaksiyonu) metodu (multipleks ve touch down) ile gerçekleştirildi.

     Çalışmada toplam 108 (%21,6) Campylobacter spp. izole edilmiştir. 108 örneğin 29'undan C. jejuni ve C. coli birlikte izole edilirken, geriye kalan 79 numuneden 46'sı C. jejuni ve 33'ü C. coli olarak tespit edilmiştir.

Bu araştırma sonucunda Konya Yöresi Broyler kümeslerinde Campylobacter spp. bulunma oranının %21.6 olduğu ortaya konmuştur. Elde edilen oran, insan sağlığı açısından bulaşmaların önlenmesine yönelik hijyen tedbirlerinin alınması gerekliliğini göz önüne sermiştir.

Anahtar Kelimeler:

Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, broyler, PZR

KLİNİK SIĞIR MASTİTİSLERİNDEN İZOLE EDİLEN STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUŞLARINDA ANTİMİKROBİYAL DİRENÇ VE BİYOFİLM OLUŞUMUNUN FENOTİPİK VE GENOTİPİK YÖNTEMLERLE ARAŞTIRILMASI

Dr. Yasin GÜLCÜ, Prof. Dr. Leyla GÜLER, Dr. Murat ŞEVİK, 

Vet Hekim Asuman SOYSAL SARIŞAHİN, Vet Hekim Ali GÖK

Konya Veteriner Kontrol Enstitüsü Müdürlüğü

ÖZET:

      Staphylocoocus aureus sığır mastitislerinin en önemli nedenlerinden biridir. Bu çalışmanın amacı klinik sığır mastitislerinden izole edilen S. aureus suşlarının antimikrobiyal direnç prevalansını; biyofilm oluşturma kapasitelerini; penicillin direnci (blaZ), methicillin direnci (mecA ve mecC) ve biyofilm oluşumu ile ilgili genlerin (ica, bap, agr) varlığını araştırmaktır. Suşların minimum inhibitör konsantrasyonu (MİK) Vitek 2, veteriner Gram pozitif antibiyogram kartı (Biomerieux) ile belirlendi. Biyofilm oluşturma kapasiteleri kalitatif olarak Congo red agar yöntemi, kantitatif olarak ise mikropleytlerde spektrofotometre ölçümü ile değerlendirildi. Antimikrobiyal direnç ve biyofilm oluşumu ile ilgili genler PCR ile incelendi. Klinik sığır mastitislerinden 2003-2015 yılları arasında izole edilen, her biri farklı çiftliklere ait 228 S. aureus suşunun penicillin, ampicillin-sulbactam, cefoxitin, oxacillin, vancomycin, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, erythromycin, gentamicin, kanamycin, enrofloxacin, clindamycin, indüklenebilir clindamycin, rifampin ve imipenem'e karşı antimikrobiyal duyarlılığı araştırıldı. S. aureus suşlarının 62'si (%27.2) test edilen antimikrobiyal etkenlerin tümüne duyarlı bulundu. En fazla direnç penicillin'e karşı tespit edildi, suşların 154'ü (%67.5) penicillin'e dirençli (MİK> 0.125) bulundu; bunların 90'ı (%58.4) tek başına, 64'ü (%41.5) diğer antimikrobiyal etkenlerle birlikte dirençli bulundu. Penicillin'den sonra en fazla direnç tespit edilen antimikrobiyal etken tetracycline olup 26 (%11.4) suş dirençli bulundu. Cefoxitin'e 5 (%2.2) suş dirençli bulunurken, vancomycin, ampicillin-sulbactam, trimethoprim-sulfamethoxazole ve imipenem'e dirençli suş bulunmadı. PCR yöntemi ile 1 suşta mecA geni tespit edildi. İncelenen 228 S. aureus suşunun 122 (%53.5) adedi blaZ geni pozitif bulundu. Congo red agarda kalitatif biyofilm oluşumu suşların %96.9'unda pozitif, mikropleytlerde kantitatif biyofilm oluşumu ise suşların %92.1'inde pozitif bulundu. Pozitif suşların  %44.7'si zayıf, %35'i orta, %12.3'ü kuvvetli pozitif olarak değerlendirildi. Biyofilm oluşumu ile ilgili genlerden icaD geni 171 (%75) suşta, icaA geni 85 (%37.28) suşta pozitif, 43 (%18.85) suşta ise icaD ve icaA birlikte bulundu; agr geni 114 (%50) suşta, bap geni ise 10 (%4.4) suşta pozitif bulundu.

      Sonuç olarak S. aureus suşlarında en fazla direnç görülen penicillin ve diğer antimikrobiyal etkenlere karşı yıllara göre MİK dağılımında önemli bir değişiklik olmadığı, artan bir direnç eğiliminin olmadığı görüldü. İncelenen suşlar arasında meticillin direnci pozitif suş oranının oldukça düşük, biyofilm oluşturma oranının ise yüksek olduğu tespit edildi.

Anahtar kelimeler: S. aureus, mastitis, antimikrobiyal direnç, biyofilm, ica, bap, agr, mec

            Türkiye'de Vektör Kaynaklı Önemli Viral Hayvan Hastalıklarının (Mavi dil- BT, Epizootik Hemorajik Ateş-EHD, Üç Gün Hastalığı-BEF ve AKABANE )  Teşhisi, Vektörlerin Tespiti ve Erken Uyarı Sisteminin Oluşturulması